如下图所示，蛋白质质谱鉴定一般都包含几个过程：蛋白质分离、蛋白质酶切、一级质谱鉴定、二级质谱鉴定。蛋白质分离是指蛋白质从细胞中分离纯化的过程，在进入质谱仪分析前需要对纯化的蛋白质酶切成多肽片段，经过一级、二级两个层级的质谱分析对蛋白质进行逐级分析，随着层级的加深，蛋白质序列分析的精度，蛋白质鉴定的准确度也得到提升。
蛋白分离纯化
在对细胞中的蛋白质分析鉴定前，首先需要对细胞进行破碎，将总蛋白质分离提纯，接着再将目标蛋白分离出来，进行进一步分析。然而在蛋白质分离纯化的过程中也有一下可能影响后续蛋白质鉴定效率的因素需要考虑：
1. 蛋白质浓缩
蛋白质样品可以用沉淀，膜分离，分离柱，冷冻干燥等各种方式进行浓缩， 具体蛋白浓缩方法应根据样品的特点进行选择，可用SDS样品液从色谱样上中洗脱蛋白，从而保持样本体积较小。
2. 蛋白质凝胶电泳
对于SDS- PAGE，传统的Laemmli式，三甘氨酸凝胶及其各种改进型的凝胶，如二，三凝胶或三盐酸凝胶， 都可以兼容于蛋白质鉴定。各种凝胶浓度也没有限制。用户选择凝胶的类型，应根据能够实现对样本的更好的分离效果而定。 出于未知原因，三，黄酮凝胶与蛋白质识别的相容性要差一些。
3. 蛋白质凝胶染色
传统的考马斯（G250或R - 250）染色剂能够有效地对蛋白质的染色。胶状考马斯染色剂包有更低的检测范围 (~5 ng BSA)。其他的染色方法，如锌/铜染色，荧光染料染色，银染色法都是可以用于蛋白质鉴定。
4. 蛋白条带切割
凝胶在切割过程中应避免与手，灯箱， 或任何其他可能的角蛋白污染源直接接触。在切割蛋白胶带适应尽量避免割下空白凝胶（它可能降低酶切的消化效率和多肽的回收率）。 将每个凝胶带置于干净的，1.5毫升的微型离心管并给每个样本小心地做上标签。
蛋白质酶切消化
蛋白质在质谱鉴定前通常需要经过蛋白质酶切消化步骤，将大分子蛋白质酶切成多肽片段，以便于提升质谱鉴定的精度。蛋白质酶切通常选用胰蛋白酶进行蛋白质酶切处理，有时也会根据预测的蛋白质序列选测多种其他蛋白酶进行酶切。蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，再经过高效液相色谱对多肽片段进行初步分离，以进一步提升质谱鉴定的准确度。
蛋白质一级质谱鉴定
蛋白质一级质谱鉴定主要便是通过测定蛋白质酶切产生的肽段质量图谱，即肽质指纹谱（peptide mass fingerprint，PMF），再将测定的肽质量与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来"断裂"蛋白所产生的）。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数作一排行榜，"冠军"肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。
肽段在质谱分析前首先经过离子化，时肽段带上一定量的电荷。通过检测器分析，可得到各肽段的质荷比（m/z），从而得知各肽段的相对分子质量。目前常用的离子化的方法有两种：基质辅助激光解析电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）。MALDI电离的基本原理是将蛋白样品点在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。ESI电离是在毛细管的出口处施加一高电压，产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。
蛋白质串联质谱鉴定
在第一阶段进行肽质指纹鉴定之后，一个有意义且丰度高的肽片段在质谱仪被选作"母离子"，母离子飞行至耳机质谱反应器中碰撞碎裂为"子离子"。在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。 连续的片段间差异即是肽片段的氨基酸质量。由氨基酸的质量可以推测出氨基酸的类别以及氨基酸上面可能发生的翻译后修饰。连续测得的氨基酸序列组成肽序列标签。然后，使用多个肽序列标签与数据库中蛋白质的序列进行比对，推测出目的蛋白质，一般得分超过95%被认为蛋白质鉴定成功。