关键词：靶向蛋白组学、SRM、生物标志物
Quantitation of putative colorectal cancer biomarker candidates in serum extracellular vesicles by targeted proteomics Scientific Reports －06 October 2017
研究方法
靶向蛋白组学 Targeted proteomics－SRM
研究结果
1. 作者通过在Pubmed中输入cancer＋colorectal＋expression搜索在2003年到2014年间报道过的直肠癌（CRC）的潜在生物标志物。这些标志物通过以下标准进行确定：通过western blot，Elisa等方法确认在CRC中表达有差异的蛋白；或通过iRNA相关实验确认与CRC疾病发展相关；以及通过大规模组学鉴定法发现的潜在生物靶点。由于血清中的蛋白众多，蛋白丰度差异大，直接对血清中的靶标进行全面研究难度较大，因此作者选用了血清中的extracellular vesicles（EVs）组分进行研究。并且制定了一下的鉴定CRC靶标的策略：先使用shotgun proteomics鉴定EVs中的所有蛋白。再从中选出CRC的潜在生物靶点，使用SRM对这些潜在靶点做定向研究，从而确认其中真实可靠的CRC生物靶点。
2. 制定鉴定策略后，作者首先提取了血清和CRC细胞的EVs，并使用了shotgun proteomics鉴定技术分别对这两个组分的所有蛋白进行鉴定。鉴定结果（图b－韦恩图）分别标明了血清、CRC细胞的EVs组分的所有蛋白和文献搜索的潜在CRC生物靶标的种类，以及各自相交重复的数量。血清、CRC的EVs组分蛋白与文献搜索的潜在CRC靶标的相交部分（下图红色加粗字体）即为EVs组分中的潜在生物靶点。
3.作者使用SRM靶向蛋白组学的研究手段对以上确认的潜在生物靶点进行了鉴定（鉴定的步骤包括靶向肽段的选取，SRM对靶向肽段的鉴定，靶向蛋白分析）。作者选取了正常人，非转移的CRC病人，转移的CRC病人的血清样品，分别提取EVs，再使用SRM进行鉴定。下图显示了部分靶向肽段在三个样品中的含量，由此反映三个样品中各项生物靶标的表达水平。其中对比对照组是否具有显著性差异也在图中进行了标注（*p < 0.05, **p < 0.01, N.S: 非显著性差异）。结果发现多数靶标蛋白属于Annexin蛋白家族，包括Annexin A3，A4，A11。
4. 在了进一步研究以上生物靶标在鉴定早期CRC的灵敏度，作者还使用了SRM对CEA（特异性鉴定后期转移CRC的生物靶标）在正常人、非转移CRC、转移的CRC三个组分的水平进行研究。结果标明CEA在非转移CRC样品中表现出差异的比例为仅38.8%，在转移性的CRC中表现差异的比例为83.3%，这反映出CEA在作为后期CRC的生物靶标更为灵敏，而在前期CRC鉴定中差异不明显。与CRC相比，先前鉴定的EVs中的生物靶标在非转移和转移的CRC样品中都具有至少近80%以上的灵敏度，这表明这些靶标蛋白能够作为前期和后期CRC的生物靶标，为CRC早期鉴定提供重要的依据。
5. 确认以上鉴定的生物靶标的可靠性后，作者选取新一组的病人样品，在这些样品中对以上靶标肽段进行了鉴定，结果标明与之前的鉴定一致，这也再次验证了以上靶标的可靠性。
